2013年01月11日

石原研究室

当研究室は2004年4月の薬学部新設と同時に研究室を立ち上げ、
スタッフとしては2008年9月までは井手助教と、2009年4月から現在は小田助教とともに研究を行っています。
2012年度の研究室所属学生は6年生6名、5年生8名、4年生8名の計22名となっており、
卒業研究の一環として以下の研究の一部からテーマを決め実験を行っています。

 

当研究室の研究テーマは以下の3つです。

 

1.薬物依存形成時の脳内神経伝達・調節変化に関する研究。
2.うつ病モデル動物などを用いたうつ病発症のメカニズムおよび薬物等治療効果発現メカニズムに関する研究。
上記テーマ1~2に関しては、脳内セロトニン神経系(図1)機能を中心に研究を進めています。
3.てんかんモデル動物を用いたてんかんの発症メカニズムおよび抗てんかん薬の治療効果発現メカニズムに関する研究。

 

図1:脳内セロトニン神経ネットワーク。セロトニン神経細胞は脳幹の縫線核に細胞体をもち大脳新皮質・海馬・線条体・側坐核など広範な脳部位に投射して脳機能を調節しています。

 

【薬物依存に関する研究】

中枢神経系、特に精神系に作用する薬物を連用したときに見られる現象の一つに薬物依存があります。
薬物依存には薬物が体内にある状態が通常(正常)となり
薬物が体内から消失すると退薬症状(禁断症状)を生じる身体依存と薬物を渇望する状態となる精神依存の2つの依存があります。
研究では精神依存のみを生じるとされる覚醒剤を主として用いて、依存形成時の脳内神経調節変化について実験を行っています。
用いている薬物はメタンフェタミンで、この薬物は脳内でドパミン(快感や欲求などに関与)、
ノルアドレナリン(意欲や覚醒などに関与)の神経伝達を亢進することで、覚醒作用を示し、
また依存につながる脳内変化を引き起こすと考えられています。
このメタンフェタミンによる依存形成とドパミン神経系の変化については古くから研究されているのに対して、
ドパミンやノルアドレナリンと相互に調節関係をもち、
メタンフェタミンによりその伝達が影響を受けるセロトニン神経系の変化についての研究はあまり行われていません。
脳内セロトニン神経系は衝動や不安などに関係する神経系です。

 

そこで、ラットを用いメタンフェタミンを反復投与した後に、脳スライスを作成し、
シナプスを介した神経伝達(集合活動電位)を指標にセロトニン受容体機能の変化について実験を行っています。
対象として実験をしています脳部位は大脳辺縁系の一領域である「海馬」および「側坐核」です。
海馬は記憶や情動などに深く関係する脳部位であり、
側坐核は報酬効果などに深く関係する脳部位でいずれも薬物依存状態と密接に関係すると考えられています。

 

メタンフェタミンを連続投与した後、翌日(24時間後)に脳スライスを作成し、
セロトニンによるシナプス反応への影響を測定すると、
海馬および側坐核の2つの領域ともに生理食塩水投与群と同程度の抑制が観察され、
メタンフェタミン投与による影響(変化)は観察されませんでした。
しかしながら、連続投与終了後5日目に同様の実験を行うと、
海馬ではセロトニンによるシナプス反応抑制作用がメタンフェタミン群で増強されており、
逆に側坐核ではセロトニンによる抑制作用が減弱していました。
この変化は同様の実験を連続投与終了後10日目に行うと回復傾向にあることが示されました。
生理食塩水を連続投与したラットから作成した脳スライスの側坐核で記録された
集合活動電位とその反応に対するセロトニン(5-HT 100mM)の効果例を図2に示します。
現在は、この側坐核でのセロトニン調節変化に関与するセロトニン受容体サブタイプの関与について検討し、
細胞内情報伝達系を含め関与するメカニズムについて解明を進めています。
別の依存誘発薬物として麻薬であるモルヒネを用いて同様の研究を行っており、
セロトニンの作用変化については2013年3月の第86回日本薬理学会年会にて発表する予定です。

 

図2:側坐核スライスで記録された集合活動電位例。集合活動電位は細胞外に設置した電極により記録するため、刺激後約5msの潜時で約0.3~1.0mVの大きさの集合活動電位が記録されます。この集合電位はセロトニン(5-HT)適用によって抑制されます。この抑制効果はセロトニンを洗浄すると回復します。

 

さらに、昨年度からはマウスを用いて精神依存状態の行動の指標となる、
メタンフェタミンを処置した場所を好きになる「条件付け場所嗜好性試験(CPP試験)」を用いて、
精神依存状態の軽減効果を示す薬物およびセロトニン受容体に関する研究をスタートしています。

 

(発表論文など 依存)

1.K. Ishihara, N. Takahashi, N. Komoto, Changes in serotonergic modulation of neuronal activity in the nucleus accumbens following repeated methamphetamine administrations in rats. International Journal of Neuropsychopharmacology, 15(Suppl.1): 70-71, (2012).

2.S. Ide, M. Minami, K. Ishihara, G.R. Uhl, M. Satoh, I. Sora, K. Ikeda,  Abolished thermal and mechanical antinociception but retained visceral chemical antinociception induced by butrophanol in m-opioid receptor knockout mice.  Neuropharmacology, 54: 1182-1188 (2008).

3.S. Ide, H. Kobayashi, H. Ujike, N. Ozaki, Y. Sekine, T. Inada, M. Harano, T. Komiyama, M. Yamada, M. Iyo, N. Iwata, K. Tanaka, H. Shen, K. Iwahashi, M. Itokawa, M. Minami, M. Satoh, K. Ikeda, I. Sora, Linkage disequilibrium and association with methamphetamine dependence/psychosis of mu-opioid receptor gene polimorphisms.Pharmacogenomics J., 6(3): 179-188 (2006).

4.S. Ide, M. Minami, K. Ishihara, G.R. Uhl, I. Sora, K. Ikeda, Mu opioid receptor-dependent and independent components in effects of tramadol. Neuropharmacology, 51: 651-658 (2006).

5.T. Kimura, K. Ishihara, K. Ozawa, M. Sasa,  Augmentation of serotonin-induced inhibition of neuronal activities in the hippocampus following repeated treatment with methamphetamine. Annals of the New York Academy of Sciences, Vol.1025, 242-247 (2004).

6.S. Ide, H. Kobayashi, K. Tanaka, H. Ujike, Y. Sekine, N. Ozaki, T. Inada, M. Harano, T. Komiyama, M. Yamada, M. Iyo, K. Ikeda, I. Sora, Gene polymorphisms of the m opioid receptor in methamphetamine abusers. Annals of the New York Academy of Sciences, 1025: 316-324 (2004).

7.T. Amano, H. Matsubayashi, T. Momiyama, K. Ishihara, N. Todo, M. Sasa,  Antagonizing effects of a novel antipsychotic quinolinone derivative (OPC-14597) on dopaminergic inhibition of neuronal activities in the nucleus accumbens. Progress in Neuro-Psychopharmacology and Biological Psychiatry, 19(1): 105-116 (1995).

【うつ病に関する研究】

これまでの研究では、薬物抵抗性うつ病の治療に用いられ、薬物よりも効果の発現が早いとされる、「電撃痙攣ショック療法」により、
うつ病にも密接に関与する海馬のセロトニン神経系調節変化についてラットを用いて実験を行ってきました。
その結果はセロトニン受容体サブタイプのひとつである5-HT1A受容体の反応は増強され、
神経伝達物質セロトニンによる神経活動の抑制が増強されることが示されました。
また、抑制性神経伝達物質の放出を引き起こすセロトニン受容体サブタイプである5-HT3受容体の反応も増強されますが、
神経活動を興奮させるサブタイプである5-HT4受容体の反応には変化が認められませんでした。
これらのことは電気ショック療法によって海馬内でのセロトニンによる神経活動が抑制方向に増強されることが明らかとなり、
うつ病治療効果にセロトニン神経調節が関与することを証明し、
現在使用されている抗うつ薬の治療効果につながると考えられる機構を明らかにしてきました。

 

現在はこの研究を発展させて、より早期にうつ病の治療効果が発現できる薬物を探索するための研究を行っています。
抗うつ薬によってはセロトニンなどの神経伝達も影響を受けますが、
反復投与することにより脳内の神経栄養因子にも影響が出ることが近年の研究により明らかにされています、
神経栄養因子は脳神経の保護や神経細胞新生促進に関与し、
一部のうつ病患者で報告がある海馬の体積減少を回復させる可能性がある事象として注目されています。
現在までに他の研究室などで主に研究が行われているのは脳由来神経栄養因子(brain-derived neurotropic factor: BDNF)ですが、
当研究室ではこれ以外に関与する物質の探索を行っています。
治療効果発現に関与する物質がわかれば、治療開始から関連薬物を用いることで早期治療効果が期待できるのではないかと考えています。
現在までに、関与の可能性があると考えられる分子として抗酸化活性を持つグルタチオンペルオキシダーゼ(GPx1)が抗うつ薬処置により増加することを見出しています(2012年11月学会発表)。
栄養因子については現在検討中であり、一部のデータを2013年3月の第86回日本薬理学会年会にて発表する予定です。

 

(発表論文など うつ(ストレス))

8.T. Oda, T. Kume, Y. Izumi, K. Ishihara, H. Sugimoto, A. Akaike, Na+/Ca2+ exchanger inhibitors inhibit neurite outgrowth in PC12 cells. Journal of Pharmacological Sciences, 116: 128-131 (2011).

9.S. Ide, S. Fujiwara, M. Fujiwara, I. Sola, K. Ikeda, M. Minami, G.R. Uhl, K. Ishihara, Antidepressant-like effect of venlafaxine is abolished in m-opioid receptor-knockout mice.  Journal of Pharmacological Sciences, 114: 107-110 (2010).

10.S. Ide, I. Sora, K. Ikeda, M. Minami, G.R. Uhl, K. Ishihara, Reduced emotional and corticosterone responses to stress in m-opioid receptor knockout mice. Neuropharmacology, 58: 241-247 (2010).

11.井手聡一郎石原熊寿, 遺伝子改変マウスを用いた生体内ストレス応答におけるオピオイド神経系の調節機構に関する研究. 医科学応用研究財団研究報告,Vol.25: 161-165 (2008).

12.K. Ishihara, M. Sasa,  Failure of repeated electroconvulsive shock treatment on 5-HT4 receptor-mediated depolarization due to protein kinase A system in young rat hippocampal CA1 neurons. Journal of Pharmacological Sciences, 95: 329-334 (2004).

13.K. Ishihara, M. Sasa, Potentiation of 5-HT3 receptor functions in the hippocampal CA1 region of rats following repeated electroconvulsive shock treatment. Neuroscience Letters, 307: 37-40 (2001).

14.K. Ishihara, T. Amano, H. Hayakawa, S. Yamawaki, M. Sasa. Enhancement of sertonin1A receptor function following repeated electroconvulsive shock in young rat hippocampal neurons in vitro. International Journal of Neuropsychopharmacology, 2(2): 101-104 (1999).

15.石原熊寿,笹 征史, Electroconvulsive therapyはなぜ効くのか ―電気生理学的観点から―. 脳の科学, 21: 163-169 (1999).

16.石原熊寿,笹 征史, セロトニン受容体. 薬局, 50: 1350-1357 (1999).

17.石原熊寿,笹 征史, シグマ受容体の機能―電気生理学的アプローチ. 日本薬理学雑誌, 114: 69-76 (1999).

18.K. Ishihara, M. Sasa. Mechanism underlying the therapeutic effects of electroconvulsive therapy (ECT) on depression. Japanese Journal of Pharmacology, 80: 185-189 (1999).

【てんかんに関する研究】

てんかんは脳内の興奮性の神経系と抑制性の神経系のバランスが崩れることによって、
神経細胞に過剰な放電が引き起こされ、それが「けいれん」などの発作として現れてくる慢性疾患です。
けいれんは外的にも観察が容易な発作ですが、短時間の意識消失のみが発現する発作も見られる病態もあります。
一般にてんかんの治療は薬物療法が主になりますが、
全ての患者の発作が承認されている抗てんかん薬でコントロールできるわけではありません。
ここ数年、既存の薬物で効果不十分な場合に併用投与で治療を行うための新しい薬物がいくつか承認されています。
新しい薬物の使用は併用療法が原則ですが、さまざまな新しい作用機序を持っていることがわかっています。
この治療メカニズムを研究することで、さらに新しい治療薬開発につながるのではないかと考えています。

 

当研究室で行っている研究は、京都大学医学部付属動物実験施設にて開発された、
自然発症てんかんラット(Spontaneously epileptic rats: SER)を用いて行っています。
SERは8~9週令以降に外的刺激なしに、強直性けいれんと欠神様発作の2種の発作を起こし、
それぞれの発作に対する既存の治療薬の効果はヒトの強直間代発作と欠神発作の治療薬の効果と相関性があることがわかっており
てんかん動物モデルとして非常に有用なものと考えられています。

 

このSERの研究においても、海馬を用いています。
海馬は上記の脳機能の他にてんかん発作発現にも関与する脳部位です。
SERの海馬では、その一領域で、通常の神経伝達において起こりうる刺激を与えるだけで、
繰り返し放電が起こるような異常活動が観察されます。
SER海馬の単一神経細胞内に電極を刺入して得られる活動電位は、正常のものとは全く異なり、
持続時間が長く、スパイクが頻発するタイプの活動電位が多くの神経細胞で観察されます(図3)。
この異常な持続の活動電位はカルシウムチャネル拮抗薬で抑制されることを明らかにしました。

 

図3:自然発症てんかんラット(SER)の海馬ニューロン異常活動電位(細胞内記録実験)。SERの海馬ニューロンでは右に示します非けいれんラットと同程度の強度の刺激で,持続性の活動電位と頻回発射が引き起こされます。

 

さらに単一の神経細胞の単一種の電流のみを観察できるパッチクランプホールセル記録を行うと、
SERの神経細胞では、カルシウムチャネルの開口閾値電位が低下している神経細胞タイプがあること、
また別のタイプの神経細胞では閾値電位は変化していませんが、
電流の減衰がほとんど無く、開口時間が長くなっているものもあることを明らかにしています。
この異常なSERのカルシウムチャネル電流に対して、
新規抗てんかん薬のひとつであるレベチラセタムは閾値の低下した神経細胞(Type1ニューロン)では、
閾値を正常なものと同等にまで変化させること、閾値が低下していない神経細胞(Type2ニューロン)では、
正常なラットの同じ電流と比較し、電流抑制作用が強く発現することを明らかにしました(図4)。
現在は、カルシウムチャネルサブユニットたんぱく質分子における調節変化について研究を行っています。

 

図4:SER海馬ニューロンで記録されるカルシウムチャネル電流に対する新規抗てんかん薬レベチラセタム(LEV)の抑制効果。SER Type1ニューロンではカルシウムチャネルの開口閾値低下も観察されますが、電流はLEV 100mMにより抑制されます。

 

(発表論文など てんかん)

19.H.-D. Yan, K. Ishihara, T. Seki, R. Hanaya, K. Kurisu, K. Arita, T. Serikawa, M. Sasa, Inhibitory effects of levetiracetam on the high-voltage activated L-type Ca2+ channels in hippocampal CA3 neurons of spontaneously epileptic rat (SER). Brain Research Bulletin, 90: 142-148 (2013).

20.H.-D. Yan, K. Ishihara, R. Hanaya, K. Kurisu, T. Serikawa, M. Sasa, Voltage-dependent Calcium Channel Abnormalities in Hippocampal CA3 Neurons of Spontaneously Epileptic Rats.  Epilepsia, 48(4): 758-764 (2007).

21.H.-D. Yan, C. Ji-qun, K. Ishihara, T. Nagayama, T. Serikawa, M. Sasa, Separation of antiepileptogenic and antiseizure effects of levetiracetam in the spontaneously epileptic rat (SER). Epilepsia, 46: 1170-1177 (2005).

22.C. Ji-Qun, K. Ishihara, T. Nagayama, T. Serikawa, M. Sasa,  Long-lasting antiepileptic effects of levetiracetam against epileptic seizures in the spontaneously epileptic rat (SER): Differentiation of levetiracetam from conventional antiepileptic drugs.Epilepsia, 46: 1362-1370 (2005).

23.H.-D. Yan, K. Ishihara, T. Serikawa, M. Sasa, Activation by N-acetyl-L-aspartate of acutely dissociated hippocampal neurons in rats via metabotropic glutamate receptors. Epilepsia, 44(9): 1153-1159 (2003).

24.R. Hanaya, M. Sasa, Y. Kiura, K. Ishihara, T. Serikawa, K. Kurisu, Epileptiform burst discharges in hippocampal CA3 neurons of young but not mature Noda epileptic rats (NER). Brain Research, 950(1-2): 317-320 (2002).

25.H. Amano, T. Amano, H. Matsubayashi, K. Ishihara, T. Serikawa, M. Sasa, Enhanced calcium influx in hippocampal CA3 neurons of spontaneously epileptic rats. Epilepsia, 42(3): 345-350 (2001).

26.T. Amano, H. Amano, H. Matsubayashi, K. Ishihara, T. Serikawa, M. Sasa, Enhanced Ca2+ influx with mossy fiber stimulation in hippocampal CA3 neurons of spontaneously epileptic rats. Brain Research, 910(1-2): 199-203 (2001).

27.T. Akimitsu, K. Kurisu, R. Hanaya, K. Iida, Y. Kiura, K. Arita, H. Matsubayashi, K. Ishihara, K. Kitada, T. Serikawa, M. Sasa. Epileptic seizures induced by N-acetyl-L-aspartate in rats: in vivo and in vitro studies. Brain Research, 861: 143-150 (2000),

28.K. Fukao, T. Momiyama, K. Ishihara, H. Ujihara, Y. Fujita, K. Taniyama, T. Serikawa, M. Sasa,Inhibition by g-aminobutyric acid system activation of epileptic seizures in spontaneously epileptic rats. Japanese Journal of Pharmacology, 76(4): 387-396 (1998).

29.R. Hanaya, M. Sasa, H. Ujihara, K. Ishihara, T. Serikawa, K. Iida, T. Akimitsu, K. Arita, K. Kurisu,  Suppression by topiramate of epileptiform burst discharges in hippocampal CA3 neurons of spontaneously epileptic rat in vitro. Brain Research, 789(2): 274-282 (1998).

30.K. Iida, M. Sasa, T. Serikawa, A. Noda, K. Ishihara, T. Akimitsu, R. Hanaya, K. Arita, K. Kurisu,  Induction of convulsive seizures by acoustic priming in a new genetically defined model of epilepsy (Noda epileptic rat: NER). Epilepsy Research, 30(2): 115-126 (1998).

31.R. Hanaya, M. Sasa, K. Ishihara, T. Akimitsu, K. Iida, T. Amano, T. Serikawa, K. Arita, K. Kurisu, Antiepileptic effects of 20-hydroxyecdysone on convulsive seizures in spontaneously epileptic rats. Japanese Journal of Pharmacology, 74(4): 331-335 (1997).

32.T. Kanda, M. Kurokawa, S. Tamura, J. Nakamura, A. Ishii, Y. Kuwana, T. Serikawa, J. Yamada, K. Ishihara, M. Sasa, Topiramate reduces abnormally high extracellular levels of glutamate and aspartate in the hippocampus of spontaneously epileptic rats(SER). Life Sciences, 59(19): 1607-1616 (1996).

33.T. Momiyama, K. Ishihara, K. Kimura, N. Todo, Y. Fujita, T. Serikawa, M. Sasa, Long-term antiepileptic effects of chronic intake of CNK-602A, a thyrotropin-releasing hormone analogue, on spontaneously epileptic rats. Epilepsia, 37(4): 328-331 (1996).

34.T. Momiyama, K. Ishihara, T. Serikawa, K. Moritake, M. Sasa, Effect of nicardipine on abnormal excitability of CA3 pyramidal cells in hippocampal slices of spontaneously epileptic rats. European Journal of Pharmacology, 280(2): 119-123 (1995).

35.J. Nakamura, S. Tamura, T. Kanda, A. Ishii, K. Ishihara, T. Serikawa, J. Yamada, M. Sasa,  Inhibition by topiramate of seizures in spontaneously epileptic rats and DBA/2 mice. European Journal of Pharmacology, 254(1-2): 83-89 (1994).

36.K. Ishihara, M. Sasa, T. Momiyama, H. Ujihara, J. Nakamura, T. Serikawa, J. Yamada, S. Takaori, Abnormal excitability of hippocampal CA3 pyramidal neurons of spontaneously epileptic rats (SER), a double mutant. Experimental Neurology, 119(2): 287-290 (1993).

37.X. Renming, K. Ishihara, M. Sasa, H. Ujihara, T. Momiyama, Y. Fujita, N. Todo, T. Serikawa, J. Yamada, S. Takaori, Antiepileptic effects of CNK-602A, a novel thyrotropin-releasing hormone analog, on absence-like and tonic seizures of spontaneously epileptic rats. European Journal of Pharmacology, 223(2-3): 185-192 (1992).

 

薬学部 薬学科 教授 石原熊寿

ヒロコク役立つ・研究ブログでは、本学教員の研究活動による、発明や研究成果をブログ形式で定期的に発信していきます。